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15 第十二章 新药临床前药物代谢动力学研究

rxy45398
2010-04-14 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《15 第十二章 新药临床前药物代谢动力学研究pdf》,可适用于自然科学领域

第十二章新药临床前药物代谢动力学研究第一节新药临床前药物代谢动力学研究的目的和意义创新药物的开发是一项高风险、高投入和高回报的产业。一旦一个创新药物开发成功并上市就可以为开发者带来巨额的利润。但目前创新药物开发的成功率的很低,命中率约为五万分之一,在发达国家开发成功一种新药需要耗资亿美元左右,研究周期约在年左右。许多体外研究认为很有前途的候选化合物可能因在体内活性很低甚至无体内活性或体内具有较大的毒性而夭折造成极大的人力和财力的浪费。缺乏体内活性可能是由于其药动学性质不理想如首关消除较强或不易通过肠黏膜被吸收生物利用度太低或代谢太快半衰期太短或不易通过生物膜而进入靶器官。而体内的毒性则可能是由于其在体内形成的毒性代谢物所致。据文献报道进入临床试验后约有的候选化合物是由于药动学方面的原因而被淘汰的这足以说明药动学研究在创新药开发研究中的作用。一个候选化合物不仅要有较高的体外活性和较低的毒性还应具有理想的药动学性质即较高的生物利用度和理想的半衰期。因此在新药开发的早期阶段可利用各种体内和体外模型对候选化合物药动学进行初筛以便在研究开发的早期就确定该候选化合物是否有继续开发的价值并可以根据筛选的结果对先导化合物进行结构改造或修饰以获得具有良好药动学特性的新候选化合物。最优的候选化合物是从一次次的优化循环中诞生的每一次的优化循环都通过药理学、毒理学和药动学筛选结果反馈来指导下一步合成或结构改造。这样循环往复最终产生具有良好的药理学、毒理学和药动学特性的最佳候选化合物进入下一步的临床研究。由此可见新药的临床前药动学研究在创新药物的开发研究中占有重要的地位它与临床前药理学研究和毒理学研究一起构成一个三位一体的完整的新药筛选和评价体系。临床前药动学研究的目的是阐明新药在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点并提供一些重要的药动学参数进而揭示新药在体内动态变化规律性包括吸收的速度和程度全身分布情况药物的血浆蛋白结合率阐明代谢物的结构、转化途径及其动力学排泄的途径、速率和排泄量。它可以为设计和优化临床研究给药方案提供理论依据确保临床用药的安全性和合理性。同时还可为药效学和毒理学评价提供重要的线索有助于我们了解药效或毒性的靶器官阐明药效或毒性产生的物质基础进而为新药的开发提供线索对发展更为安全有效的新药及拟定解毒措施都有极其重要的指导意义。第二节新药临床前药物代谢动力学研究的内容和方法新药临床前药动学研究主要包括四个方面的内容即药物的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)简称ADME又称药物体内过程。一.临床前药动学研究实验设计的基本原则实验药品实验所用的药品应与药效学和毒理学研究使用的药品相一致。实验动物一般采用健康成年动物。常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬和猴等。实验动物选择的基本原则如下:()首选动物尽可能与药效学和毒理学研究所用的动物一致。()尽量在清醒状态下实验动力学研究最好从同一动物多次采样。()创新药应选用两种或两种以上的动物其中一种为啮齿类动物另一种为非啮齿类动物其主要目的是要了解药物的体内过程是否存在明显的种属差异。其他类型的药物可选用一种动物(首选非啮齿类动物如犬等)。()实验中应注意雌雄动物兼用以便了解药物的体内过程是否存在明显的性别差异如发现存在明显的性别差异应分别研究药物在雌雄动物体内的动力学过程。()口服药药物不宜选用兔等食草类动物因为这类动物的吸收不规则。剂量选择临床前药动学研究应设置至少三个剂量组剂量的选择可以参考药效学和毒理学研究中所用的剂量其高剂量最好接近最小中毒剂量中剂量相当于有效剂量这样所得结果更有利于解释药效学和毒理学研究中的现象。设置三个剂量的主要目的是考察药物在体内的动力学过程是否属于线性如为非线性动力学要研究剂量的影响。、给药方式和途径所用的给药途径和方式应尽可能与临床用药一致对于大动物(如犬等)应使用与临床一致的剂型。.生物样品中药物分析方法的选择目前常用的生物样品分析方法主要有以下几种:()色谱法:包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、色谱-质谱联用法(LCMS、LCMSMSGCMS)等()免疫学方法:包括放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等()放射性核素标记法()微生物学方法。由于生物样品具有取样量少、药物浓度低、干扰物质多及个体差异大等特点所以必须根据待测物的结构和理化性质、生物介质和预期的浓度范围建立适宜的生物样品分析方法并对方法进行确证。所建立的方法必须具有足够的灵敏度、专一性、精确性和可靠性并对方法进行确证以确保生物样品测定结果的准确性和可靠性。二.临床前药动学研究方法和内容.血药浓度时间曲线()动物数的确定:一般以药时曲线的每个时间点不少于只动物数据为限计算所需动物数。药时曲线最好从同一动物多次取样尽量避免用多只动物合并样本如采用多只动物合并样本应相应增加动物数以减少个体差异对试验结果的影响。考虑到药动学可能存在明显的性别差异一般受试动物采用雌雄各半如发现药动学确实存在明显的性别差异应增加动物数以便了解药物在雌雄动物体内的药动学的差异情况。对于单一性别用药的药物可选择与临床用药一致的性别的动物进行药动学研究。()采样点的确定:采样点的确定对药动学参数的估算有直接的影响若取样点过少或选择不当所得的药时曲线可能不能真实地反映药物在体内的动态变化规律性由此计算的药动学参数也就失去了意义。一个完整的药时曲线应包括药物的吸收分布相、平衡相和消除相采样点的设计应兼顾到这三个时相(如图所示)。一般在吸收分布相至少需要~个采样点平衡相至少需要个采样点消除相至少需要~个点。整个采样时间至少应持续到~个半衰期或持续到血药峰浓度Cmax的~。()给药剂量和途径:药时曲线研究至少应设置三个剂量组以便考察药物在体内的动力学过程是否属于线性过程剂量的选择可以参考药效学和毒理学研究中所用的剂量其中一个剂量相当于有效剂量。所用的给药途径和方式应尽可能与临床用药一致如为口服给药一般应在给药前应禁食小时以上以排除食物对药物吸收的影响。一般情况下只需要进行单剂量给药的药动学研究但对于半衰期长(给药间期短于个半衰期)、有明显的蓄积倾向且临床需长期给药的药物应考虑进行多次给药的药动学研究。()药动学参数的估算:根据测得的血药浓度时间数据采用房室模型或非房室模型的方法估算出其药动力学参数。对于静脉注射给药的药物应提供消除半衰期t、表观分布容积Vd、血药浓度时间曲线下面积AUC、清除率CL等参数值对于血管外给药的药物而言除提供上述的参数外还应提供峰浓度Cmax、达峰时间Tmax、等参数值。对于药动力学参数的估算目前一般主张采用非房室模型的方法来估算因为随着药动学研究的不断深入人们逐渐认识到房室模型的一些不足之处采用房室模型估算的有些药动力学参数常常与实测值存在较大的差异。时间(min)浓度(ugml)图大鼠灌服高、中、低三个剂量盐酸雷诺嗪后的平均血药浓度时间曲线.药物的吸收药物的吸收研究主要是针对血管外给药的药物而言的它主要包含了两方面的研究内容即吸收的速度和程度。对于失眠、疼痛等急性病的治疗一般希望单剂量给药后药物能够迅速地到达体循环并发挥疗效对于这类药物而言药物的吸收速度是至关重要的。另一方面对于高血压、糖尿病和癫痫等慢性病的治疗常常需要重复多次给药治疗此时药物的吸收程度就成了更重要的因素。因此对于药物的吸收研究应根据具体的药物有所侧重。()吸收速度药物的吸收速度可以通过血药浓度时间曲线来反映吸收速度快的药物往往达达峰时间短且峰浓度高吸收速度慢的药物则正好与之相反。因此药物在体内的Cmax和Tmax是反映药物吸收速度的两个最直观的指标和参数常常被用于评价药物的吸收速度。()吸收的程度药物的吸收程度则可以通过血药浓度时间曲线下面积AUC来反映AUC的面积越大表明药物的吸收越好因此AUC是评价药物吸收程度的一个主要和重要的指标和参数。对于血管外给药的药物应尽可能提供其绝对生物利用度即通过比较静注给药的AUC和血管外给药后的AUC来研究血管外给药的吸收速度和程度及绝对生物利用度以便确定临床的最佳给药途径和剂型。对于狗猴等大动物所用剂型应与第Ⅰ期临床试验相同。()吸收机理对于口服的创新药物而言除应进行整体动物实验以便通过药时曲线来了解药物在体内的吸收情况还可采用体外吸收模型(如Caco细胞模型)以及在体或离体组织吸收模型(如离体肠管外翻模型、UssingChambers模型及在体或离体肠灌流模型)研究药物吸收特性和机理。其中Caco细胞模型是近年来建立的一种新的体外吸收模型具有同源性好(与肠上皮细胞结构相似)、所需药量少、与体内吸收的相关性好、可进行批量操作和成本低等特点因此尤其适合于创新药物早期的吸收筛选研究。可用于研究细胞对药物的摄取及跨膜转运也可用于研究药物肠内代谢机制。目前Caco细胞模型已经被广泛地用于体外吸收的研究主要用于研究药物吸收机理及影响吸收的因素进而了解药物的吸收特点及其影响因素。如采用Caco细胞模型研究了氯苄律定、黄芪甲甙和盐酸关附甲素的体外吸收和体内吸收的相关性结果见表结果表明药物的体内外吸收具有高度的相关性。表药物在Caco细胞模型中的通透系数(Papp)与体内吸收的相关性药物名称药物浓度(μgml)Papp(cm·sec)绝对生物利用度()氯苄律定×黄芪甲甙×盐酸关附甲素×.药物的分布药物的组织分布试验主要是要了解药物在全身各组织的分布情况。组织分布试验一般选用大鼠或小鼠选择一个剂量(一般以有效剂量为宜)给药后以药时曲线作参考选个时间点(每个时间点至少应有个动物的数据)分别于吸收分布相、平衡相和消除相取样测定药物在心、肝、脾、肺、肾、胃、肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的浓度以了解药物在体内的主要分布组织特别应关注药物在靶器官(包括药效学与毒理学)的分布。如大鼠灌胃mgkg盐酸雷诺嗪后分别于、和min采集组织样本采用LCMS法测定药物在各组织中的浓度其组织分布如图所示结果表明盐酸雷诺嗪在体内分布较广,但未见有组织蓄积倾向。其中以肝、肺、肾、胃、肠和脾浓度最高,提示这些组织可能是其毒性靶器官。若某组织的药物浓度较高、持续时间长且临床上需要长期服用的药物应研究其毒理学意义及体内的蓄积情况。对于单剂量给药后有明显的蓄积倾向、半衰期长(给药间期短于个半衰期)且临床需长期给药的药物应考虑进行多次给药后的组织分布研究以便进一步了解多次给药后药物在体内的蓄积情况。脑肌脂心肝肺肾胃肠脾卵血组织药物浓度(ugg)minminmin图大鼠灌胃mgkg盐酸雷诺嗪后组织中药物浓度.血浆蛋白结合试验药物进入血浆或组织后其中部分药物可与其中的蛋白质结合而形成结合型药物(bounddrug)另一部分则以游离状态存在称之为游离型药物(freedrug)。在血浆中药物主要与白蛋白结合此外也可与血浆α球蛋白和酸性糖蛋白结合。药物与血浆蛋白的结合对药物的转运和药理活性会产生直接或间接影响结合型的药物无法通过生物膜因而不能进行转运并暂时失去药理活性但由于药物与血浆蛋白的结合是疏松和可逆的结合型药物与游离型药物之间常常处于动态平衡之中因此药物与血浆蛋白的结合对药物的转运和药理活性的影响是暂时的可以把它看成是药物的一种储存形式。另外药物与血浆蛋白的结合率可受到许多因素的影响而发生变化。其一由于血浆中蛋白质的含量及与药物结合的部位是有限的因此药物与血浆蛋白的结合具有饱和性当药物的浓度大于血浆蛋白的结合能力时会导致血浆中游离型药物的急剧增加进而引起毒性反应其二药物与血浆蛋白的结合有置换现象。当两个高蛋白结合率的药物合用时就会出现置换抑制其结果是一种药物被另一种药物所游离出来使前者在血浆中的游离型药物的浓度急剧增加如保泰松可以把结合型的双香豆素游离出来而使血浆中游离型的双香豆素浓度成倍地增加而导致出血倾向其三某些病理状态下如慢性肾炎、肝硬化等可以导致血浆蛋白含量降低使药物的血浆蛋白结合率降低游离药物浓度增加。有些药物在老年人中呈现出较强的药理效应部分与老年人的血浆蛋白减少有关。因此药物的血浆蛋白结合率是药物重要的药动学参数之一。药物在血浆中与蛋白结合的程度不一常用血浆蛋白结合率来表示其结合的程度血浆蛋白结合率可按下式计算:蛋白结合率()=(CtCf)Ct×其中Ct为游离型和结合型药物的总浓度Cf为游离型药物的浓度。目前常用的血浆蛋白结合试验的方法有平衡透析法、超过滤法、分配平衡法等可以根据药物的特点选择其中的一种方法研究药物的血浆蛋白结合率至少应进行三个浓度(应包括有效浓度在内)下的血浆蛋白结合率试验以了解其血浆蛋白结合率及其是否有剂量依赖性。对于结合率大于的药物应考虑研究影响结合的各种因素包括配伍用药物。.药物的排泄排泄(excretion)是药物从体内消除的一种重要的方式之一。药物进入体内后可以原形或其代谢产物的方式经排泄器官排出体外。其主要的排泄途径为尿液、胆汁和粪便肾脏是药物的主要排泄器官。有些药物还可以通过呼吸道、唾液、乳汁、汗液排泄。()药物的尿和粪排泄:药物的尿和粪排泄研究一般采用小鼠或大鼠(每个时间段至少有只动物的试验数据)将动物放入特制的代谢笼内选择一个有效剂量给药后按一定的时间间隔分段收集尿或粪的全部样品包括药物从尿或粪中开始排泄、排泄高峰及排泄基本结束的全过程。记录尿体积混匀取一部分样品测定尿药浓度计算药物经尿液排泄的速度及总排出量(占总给药量的百分比)粪便样品可先制成匀浆记录总体积取部分样品进行药物含量测定也可先称重后研磨均匀取一定量进行药物测定计算药物经粪便排泄的速率及总排泄量(占总给药量的百分比)。如盐酸雷诺嗪在大鼠尿液和粪便中排泄大鼠按mgkg灌胃给予盐酸雷诺嗪,分别放入代谢笼中,收集~、~、~、~和~小时尿液和粪便。准确测量尿体积取尿液ml测定尿药浓度,并根据尿药浓度和尿液体积折算成尿药量计算尿累积排泄量和尿累积排泄百分率粪便用水定量制成匀浆后,取ml匀浆液测定粪便匀浆中药物的浓度折算成粪药量、粪累积排泄量和粪累积排泄百分率。盐酸雷诺嗪在大鼠尿液和粪便中的累积排泄曲线见图和图结果显示尿液是盐酸雷诺嗪的主要排泄途径仅有少量的药物通过粪便排泄。时间(h)尿液累积排泄百分率()图盐酸雷诺嗪(igmgkg)在大鼠尿中的累积排泄曲线时间(h)粪便累积排泄百分率()图盐酸雷诺嗪(igmgkg)在大鼠粪中的累积排泄曲线()胆汁排泄:一般用大鼠在乙醚麻醉下作胆管插管引流待动物清醒后以预先确定的途径给药并以合适的时间间隔分段收集胆汁记录胆汁体积取一部分样品进行药物测定计算药物经胆汁排泄的速率及总排泄量(占总给药量的百分比)。如盐酸雷诺嗪在大鼠胆汁中排泄大鼠用乙醚浅麻后作胆管插管手术,待动物清醒后,按mgkg灌胃给予盐酸雷诺嗪分别于给药前及给药后~、~、~、~和~小时收集胆汁。用LCMS法分析胆汁中药物排泄量,计算胆汁中药物的累积排泄百分率(见图)结果表明只有微量的药物是通过胆汁排泄的这提示胆汁不是盐酸雷诺嗪的主要排泄途径。时间(h)胆汁累积排泄百分率()图盐酸雷诺嗪(igmgkg)在大鼠胆汁中的累积排泄曲线若胆汁是药物的重要排泄途径且口服吸收良好则需要研究该药物是否存在肝肠循环。对肝是重要结构转化部位或肝摄取较多的药物则应研究药物是否存在首关消除(firstpasseffect)为设计给药方案和选择适当的药物剂型提供参考依据。.药物的生物转化药物的生物转化(biotransformation)也称为药物的代谢(metabolism)是药物从体内消除的另一种主要方式。药物进入体内后部分药物在体内各种代谢酶的作用下进行生物转化再以原型和代谢物的形式随粪便和尿液排出体外。创新药物的体内代谢研究一般应选用两种或两种以上的动物其中一种为啮齿类动物一般选用大鼠另一种为非啮齿类动物一般选用犬其主要目的是要了解药物在体内的主要的代谢方式、代谢途径、主要的代谢产物及其代谢是否存在明显的种属差异。选择一定的剂量给药后分别采集血样、尿样和粪便采用色谱方法分离和分析血样、尿样和粪便中可能存在的代谢产物如发现有代谢物则可用色谱质谱联用及色谱核磁联用等技术进一步确定主要代谢物的结构。若血药浓度与毒性、疗效缺乏相关性则应探究是否存在活性药物代谢物有必要对代谢物的活性和毒性开展进一步研究。此外也可采用体外的方法研究药物的生物转化目前常用的体外代谢模型有肝微粒体P酶、肝切片模型、肝灌流模型和肝细胞培养模型等这些方法尤其适合于创新药物的早期的药动学研究可以进行大批量的药动学筛选但采用该法所得的结果与体内代谢的一致性方面存在不足因而其实验结果一般仅用于预测体内代谢情况尚需体内代谢研究的进一步证实。在上述的几种体外代谢模型中肝微粒体P酶模型具有快速和简便的特点因而应用最为广泛如采用肝微粒体技术研究西尼地平在人肝微粒体内的代谢结果发现西尼地平在人肝微粒体内被迅速代谢为三个代谢物分别是西尼地平二氢吡啶环脱氢代谢物M、二氢吡啶环侧链脱甲基代谢物M、二氢吡啶环脱氢及其侧链脱甲基代谢物M其在人肝微粒体内的代谢途径如图所示。图西尼地平在人肝微粒体内的代谢途径、对药物代谢酶活性的影响参与药物代谢的细胞色素P同工酶一个重要的特性就是可以被诱导或抑制。许多临床常用的药物可以对P酶产生诱导或抑制作用前者可使药物的代谢加速而使药效减弱甚至失效后者则可使药物的代谢减缓而使药效增强甚至产生严重的毒副作用。因此有必要在临床前阶段观察药物对细胞色素P同工酶的诱导或抑制作用进而了解药物间的潜在的代谢相互作用。可以运用肝微粒体技术在体外研究药物在肝微粒体内的代谢情况如参与药物代谢的主要的P酶及其本身对P酶的影响药物的代谢是否存在明显的种属的差异以便我们了解该药物是否存在潜在的代谢相互作用。第三节生物样品分析技术的特点与要求一.生物样品分析方法的特点生物样品是指来自于生物机体的全血、血浆、血清、粪便、尿液或其他组织的样品与一般的含量测定样品不同之处在于生物样品中的药物浓度低、干扰物质多(包括外源性物质如食物、同服的其他药物和药物本身的代谢物等及内源性物质如激素、维生素、胆酸、脂肪酸、氨基酸和生物胺等)、取样量少以及个体的差异大。因此必须建立灵敏、专一、精确、可靠的生物样品定量分析方法并对方法进行确证这样才能确保生物样品测定结果的准确性和可靠性。二.生物样品分析方法的基本概念根据生物样品分析方法的特点下面着重介绍一些与其方法学建立和确证有关的基本概念:特异性(Specificity):指样品中存在干扰成分的情况下分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。标准曲线(CalibrationCurve):测定物质浓度与仪器响应值之间的关系一般用回归分析方法(如用加权最小二乘法)获得的回归方程即标准曲线。精密度(Precision):精密度是指在确定的分析条件下同一介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间相对标准差(RSD)来考察方法的精确度。准确度(Accuracy):是在确定的分析条件下测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度重复测定已知浓度分析物样品可获得准确度。回收率(Recovery):从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以纯标准品产生的响应值即为分析物的提取回收率。定量下限(LowerLimitofquantitation,LLOQ):是标准曲线上的最低浓度点表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。稳定性(Stability):一种分析物在确定条件下一定时间内在给定介质中的化学稳定性。重现性(Replication):不同实验室间测定结果的分散程度以及相同条件的分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。标准样品(Standard):在生物介质中加入已知量分析物配制而成的样品用于建立标准曲线计算质控样品和未知样品中分析物浓度。质控样品(QualityControl):即QC样品由独立的人员配制不同浓度的标准样品用于考察生物分析方法的效能和评价每一分析批中未知样品分析结果的正确性和可靠性。生物介质(BiologicMedium):是一种生物来源的且能以可重复的方式采集和处理的物质例如全血、血浆、血清、尿、粪、或各种组织等。介质效应(MediumEffect):由于样品中存在干扰物质对响应造成的直接或间接的影响。分析批(AnalysisBatch):由待测样品、标准样品和QC样品组成的一个完整系列。一天内可以完成几个分析批一个分析批也可以持续几天完成。三、生物样品分析方法的建立和确证.生物样品分析方法的选择和建立对于生物样品中微量药物的定量分析目前常用的有以下几种方法:()色谱法:高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、色谱-质谱联用法(LCMS、LCMSMSGCMS)等这种方法适用于绝大多数药物的分析测定()免疫学方法:放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等这种方法多用于蛋白质多肽类物质检测()放射性核素标记法:目前常用的标记核素有H、C、I这种方法主要用于药物在体内的分布和排泄研究解决物料平衡(MassBalance)问题即阐明药物在体内的去向。()微生物学方法主要用于抗生素类药物的测定。在上述的几种分析方法中色谱法具有灵敏度高、特异性强、准确性好的特点因此常常作为首选方法用于生物样品中微量药物的分析测定一般可以满足药动学研究的要求且绝大多数实验室也具备相应条件因此应用最广(约的体内药物浓度可以用色谱法来测定)其它的几种方法由于特异性不强常常作为替代的方法用于生物样品中微量药物的分析测定。具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性质、仪器条件以及借鉴文献方法等多方面因素来综合考虑确定。.生物样品分析方法的确证(MethodValidation)及技术要求建立准确可靠的和可重复的定量分析方法是进行临床前药动学研究的关键之一。为了确保分析方法准确性和可靠性必须对所建立的方法进行充分验证应考察方法的每一步骤确定从样品采集到分析测试的全过程中环境、介质、材料或操作上的可能改变对测定结果的影响。一般应从以下几方面进行考察:()特异性(Specificity)必须证明所测定的物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物生物样品所含内源性和外源性物质及其相应代谢物不得干扰对样品的测定。如果有几个分析物应保证每一个分析物都不被干扰。应确定保证分析方法特异性的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图(注明浓度)及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性。对于质谱法则应着重考察分析过程中的介质效应。()标准曲线和定量范围(CalibrationCurve)根据所测定物质的浓度与响应的相关性用回归分析方法(如用加权最小二乘法)获得标准曲线提供标准曲线的线性方程和相关系数说明其线性相关程度。标准曲线高低浓度范围为定量范围在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。当线性范围较宽的时候平安彩票app采用加权的方法对标准曲线进行计算以使低浓度点计算得比较准确。必须用至少个浓度建立标准曲线应使用与待测样品相同的生物介质制备标准曲线定量范围要能覆盖全部待测样品浓度不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品但计算时不包括该点。()精密度与准确度(PrecisionandAccuracy)一般要求选择个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在定量下限(LLOQ)附近其浓度在LLOQ的倍以内高浓度接近于标准曲线的上限中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定个样品为获得批间精密度应至少连续测定个分析批。精密度用质控样品的批内和批间相对标准差(RSD)表示RSD一般应小于在LLOQ附近RSD应小于。准确度一般应在~范围内在LLOQ附近应在~范围内。()定量下限(LowerLimitofquantitationLLOQ)定量下限是标准曲线上的最低浓度点要求至少能满足测定~个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax的~时的药物浓度其准确度应在真实浓度的~范围内RSD应小于。应由至少个标准样品测试结果证明。()样品稳定性(Stability)根据具体情况对含药生物样品在室温、冷冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。以保证检测结果的准确性和重现性。()提取回收率(Recovery)一般要求考察高、中、低个浓度的提取回收率高、中、低个浓度的提取回收率应大于,且其结果应当一致、精密和可重现。()方法学质控(Qualitycontrol,QC)对于未知样品的测定应在生物样品分析方法确证完成以后开始。在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。平安彩票app由独立的人员配制不同浓度的质控样品对分析方法进行考核。每个未知样品一般测定一次必要时可进行复测。每个分析批生物样品测定时应建立新的标准曲线并随行测定高、中、低三个浓度的质控样品。质控样品测定结果的偏差一般应小于%。每个浓度质控样品至少双样本并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时应增加各浓度质控样品数使质控样品数大于未知样品总数的。质控样品测定结果的偏差一般应小于低浓度点偏差一般应小于最多允许不在同一浓度的质控样品结果超限。如质控样品测定结果不符合上述要求则该分析批样品测试结果作废。浓度高于定量上限的样品应采用相应的空白介质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品应以零值计算。对于缺失样品的原因应加以说明。对舍弃任何分析数据和选择所报告的数据说明理由。总之整个分析过程应当遵从预先制订的实验室SOP以及GLP原则()微生物学和免疫学分析上述分析方法确证的很多指标和原则也适用于微生物学或免疫学分析但在方法确证中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的所以应采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线。此外,微生物学或免疫学分析方法确证实验应包括在几天内进行的个分析批每个分析批包括个浓度(LLOQ低、中、高浓度)的QC双样本。第四节新的缓、控释制剂的临床前研究的内容与方法一.研究的目的和意义对于创新的缓、控释制剂在进行临床人体试验前应进行临床前的动物试验。由于缓、控释制剂所用的剂量一般是常释制剂的一倍或一倍以上一旦所研制的缓、控释制剂未能达到预期的缓、控释效果常常会出现“突释”现象即药物被迅速的释放使血药浓度大幅升高对于那些安全范围比较窄的药物(如某些心脑血管类药物)而言就有可能产生严重的不良反应。因此为确保临床人体试验中受试者的安全有必要进行临床前的动物试验研究单剂量和多剂量服药后缓、控释制剂的药动学行为并与常释制剂比较重点考察试验制剂的释药特征尤其是该制剂是否达到了预期的缓、控释效果。二.实验设计的基本原则.实验动物的选择原则上采用成年Beagle犬体重差异一般不超过kg。对于特殊制剂可以根据具体情况选用合适的动物。.参比制剂的选择一般选择合格的常释制剂。.给药的剂量和途径一般采用与临床相同的剂量、剂型和给药途径。三.研究的内容和方法.单剂量研究试验采用双交叉实验设计将动物随机分为两组每组动物不应少于只动物。动物禁食小时以上在清醒状态下按每只动物等量给药给药剂量参照人体临床用药剂量。给药过程中制剂不得破损。于给药前及给药后不同的时间点采血血样的采集参照本章第二节“采样点的确定”项的原则设计。选用合适的分析方法测定经时过程中血浆中药物的浓度。血药浓度时间数据可采用矩量法估算相应的药动学参数。至少应提供AUC、Tmax、Cmax、T、Cl、MRT等参数并与同剂量的常释制剂的参数进行比较对试验制剂吸收程度是否等效进行初步评价考察试验制剂是否达到了预期的的缓、控释效果。图为Beagle犬交叉口服单剂量拉贝洛尔普通片和缓释片后的平均血药浓度时间曲线与普通片相比缓释片的达峰时间明显延迟峰浓度有所降低但两者的吸收程度相似说明该缓释片达到了预期的缓释效果。浓度μm·ml时间h普通片缓释片图Beagle犬交叉口服单剂量拉贝洛尔普通片(○)和缓释片(●)后的平均血药浓度时间曲线(引自孙建国等人中国药科大学学报:).多剂量研究多剂量研究也采用双交叉实验设计将动物随机分为两组每组动物不应少于只动物。如为每日次给药时动物应空腹给药如为每日多次给药时则每日首次应空腹给药其余在进食前小时或进食后至少小时给药。连续给药个半衰期以上(一般为~天)。分别于每日首次给药前采血测定血药谷浓度以确定药物是否达到稳态。当药物达到稳态后于最后一天给药一次并取稳态时一个完整给药间隔内的血样测定分析采用矩量法估算相应的药动学参数。提供有关多次给药的药动学参数如AUCss、Tmax、Cmax、波动度(FD)和坪浓度(Css)等。并与同剂量的常释制剂的参数进行比较对试验制剂的缓、控释效果作进一步的评价同时重点考察给药后缓、控释制剂的血药浓度波动情况及是否存在“突释”现象。为缓、控释制剂的临床人体研究提供依据确保临床人体试验中受试者的安全。(柳晓泉)参考文献国家食品药品监督管理局临床前药代动力学研究技术指导原则LinJH,LuAYHRoleofpharmacokineticsandMetabolismindrugdiscoveryanddevelopmentPharmacolRev():RobertSAHighthroughputscreeningapproachesforinvestigatingdrugmetabolismandpharmacokineticsXenobiotica:BockKW,LippHP,BockHBSInductionofdrugmetabolizingenzymesbyxenobioticsXenobiotica():国家药典委员会药物制剂人体生物利用度和生物等效性指导原则中华人民共和国药典(年版)北京:化学工业出版社附录~美国FDAGuidanceforindustryBioanalyticalMethodsValidationforhumanstudies柳晓泉赵阳李丹等。西尼地平在人肝微粒体内代谢及代谢抑制中国药理学报():

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