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竹叶黄酮的分离提取

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2018-05-29 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《竹叶黄酮的分离提取docx》,可适用于市场营销领域

竹叶黄酮的分离提取、检测与成分分析姓名:周胤潇班级:微生物学号:摘要:竹叶黄酮(Bambooleafflavonoid,BLF)是我们于上世纪年代末创制的一种新型植物黄酮制剂,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂、扩冠和免疫增强活性等()。竹叶总黄酮以其巨大的资源优势和良好的药理活性将成为一种非常有前途的天然药物,具有广阔的开发前景本实验主要对竹叶中黄酮类物质的含量用紫外分光法进行测定以及高效液相色谱法对竹叶提取物的成分分析。关键词:竹叶黄酮类物质紫外分光法高效液相色谱法前言竹子为禾本科Poaceae竹亚科Bambusoideae多年生常绿植物在我国分布很广资源十分丰富。竹子在建筑、水利、农业等领域都有广泛的应用然而竹子加工利用后竹叶却总是被弃置造成了极大浪费。近年来的研究发现竹叶中含有多种活性物质其主要活性物质是黄酮类物质,含量平均在,竹叶提取物中的有效成分主要是以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷为代表的碳苷黄酮和以对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸为代表的植物酚酸为主竹叶黄酮中的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素内酯,黄酮类物质是一类天然植物成分具有显著的生理及药理活性黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用⑶。实验目的:()掌握样品的前处理的方法()掌握竹叶黄酮的提取、分离与纯化()用硝酸铝亚硝酸钠比色法测定竹叶子中总黄酮()采用超高效液相色谱(UPLC)定量分析竹叶中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸个特征性成分的量。实验材料和仪器实验材料:竹叶(摘自浙江农林大学校园内)标准样品:甲醇(分析纯)、乙醇(分析纯)、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚(分析纯)、氢氧化钠、芦丁标准品(购自中国药品生物制品检定所纯度均大于)、去离子水。芦丁标准溶液:精确称取经℃干燥至恒重的芦丁对照品mg加入甲醇溶液定容至mL配成ugmL的芦丁标准溶液。亚硝酸钠溶液:称取约g亚硝酸钠溶解在mL去离子水置于℃冰箱中备用。硝酸铝溶液:称取约g硝酸铝溶于mL去离子水中置于℃冰箱中备用molL氢氧化钠溶液:称取g氢氧化钠溶于mL去离子水中置于℃冰箱备用。实验仪器:目筛高速冷冻离心机、旋转蒸发仪、紫外分光光度计、微波炉、粉碎机、回流装置密封袋ACQUITYtradeUltraPerformanceLC超高效液相色谱系统包含二元溶剂管理器样品管理器柱温箱和二阵管阵列检测器MicromassQTofmicroTM串联质谱(美国Waters公司)实验原理及方法实验原理:浸提、洗脱原理:根据相似相溶原理对所用溶剂按黄酮类化合物的极性来选择竹叶中所含的有效活性物质主要为黄酮甙类具有较大的极性和亲水性故可以选择热水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行浸提。但由于水的极性过大且易于将蛋白质、糖类的易溶于水的成分浸提出来且水提法提取物存放易发霉从而影响黄酮类化合物的提取和分离。故本实验选用甲醇水溶液作为浸提及洗脱溶剂⑷。工艺流程()新鲜竹叶rarr洗净烘干rarr破碎rarr过筛(目)rarr回流浸提rarr抽滤rarr悬蒸rarr定容rarr测定吸光度rarr分析计算实验步骤竹叶处理采集竹叶立刻用微波炉进行杀青干燥(微波炉W间隙加热~次每次S)将烘干的竹样用粉碎机粉碎过目筛将滤过的竹样粉末放入密封袋中密封放置于℃冰箱中储存备用。竹叶黄酮的提取与纯化竹叶黄酮的提取精确称取竹样粉末各g。加入mL乙醇水溶液浸泡min。水浴锅水温℃热回流提取h。冷却至室温过滤收集滤液。在滤渣中加入mL乙醇进行二次回流min。冷却至室温收集滤液弃滤渣密封标号置于℃冰箱备用。萃取、纯化在竹样粗提取液中加入mL石油醚进行萃取脱脂脱叶绿素弃上清液取下沉液再次加入mL石油醚进行萃取重复次将提取液密封保存至℃冰箱备用。浓缩干燥将萃取过的竹叶提取液用旋转蒸发仪将其浓缩干燥将干燥后的残渣(黄酮初提物)用甲醇定容至mL容量瓶中保存于℃冰箱备用。离心将竹叶黄酮浓缩液用离心机在转速为rpm温度℃条件下离心min取上清液保存至℃冰箱备用。黄酮总含量测定硝酸铝亚硝酸钠比色法标准曲线制作:精确称取经℃干燥至恒重的芦丁标准品mg加入甲醇溶液并定容至mL配成ugmL的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液、、、、、mL移入mL具塞试管中用甲醇定容至mL各加入亚硝酸钠溶液mL振摇后放置min再加入硝酸铝溶液mL振摇后放置min再加molL氢氧化钠溶液mL用甲醇定容至mL静置min以零管为空白摇匀后在nm的波长处测定吸光度以吸光度为纵坐标、芦丁的微克数为横坐标绘制标准曲线以及求取线性回归方程。样品黄酮含量测定:取竹样黄酮提取液uL加入uL去离子水稀释倍。将稀释的黄酮提取液用甲醇定容至mL。加入亚硝酸钠溶液mL振摇后放置min。再加入硝酸铝溶液mL摇匀后放置min。加入molL氢氧化钠溶液mL用甲醇定容至mL静置min。以零管为空白摇匀后在nm波长处测定吸光度。根据芦丁标准曲线按公式计算黄酮总含量。实验结果紫外分光测定吸光度以芦丁为标准品绘制标准曲线芦丁溶液质量浓度X(ugmL)与吸光度值A的关系曲线的回归方程式:A=X。取mL提取液于mL比色管中,在nm处测定吸光度参比为空白试剂,并代入回归方程计算其质量浓度测得的A=求得X=ug/mL最终每克竹叶中黄酮含量:timestimes(divide)divide=ug竹叶提取物的特征性成分分析高效液相色谱分析:色谱条件:ACQUITYUPLCBEHC柱(mmtimesmm,mum)流动相A为的甲酸水溶液流动相B为色谱甲醇流速为mLmiddotmin分析时间:min柱温:ordmC进样体积:muL。洗脱条件:~min由B变为B,~min由B变为B。质谱条件LCMS系统使用ESI离子源在正离子模式与负离子模式下分别采集数据。数据采集范围mz~。离子源参数ESI:毛细管电压:V样品锥电压V脱溶剂室温度℃离子源温度℃雾化气(N)体积流量Lmiddothminus脱溶剂气(N)体积流量Lmiddothminus。LockMass参照溶液为:亮氨酸脑啡呔MH:MminusHminus:。样品测定:各待测液经微孔滤膜(mum)滤过后进样测定按标准曲线计算各成分的量。结果如图,负离子模式下发现样品S中可能含有对香豆酸(分子量为)图负离子模式下发现样品S中可能含有荭草苷异荭草苷(分子量均为)图竹叶黄酮的其他提取方法水溶剂提取法水提法⑻此法适用于黄酮苷类物质提取。具有成本低,对环境及人类无毒害,设备简单,适合工业化大生产,但提取率低,提取中杂质较多(如无机盐,蛋白质,糖类等),后续分离麻烦,现在很少单一使用此法。微波提取法微波法原理⑼是利用磁控管所产生的每秒亿次超高频率的快速震动,使材料内分子互碰撞、挤压,使得位于细胞内的有效成分从细胞壁周围自由流出,传递转移至萃取介质周围,在较低的温度下背萃取介质获取并溶解其中。此法具有提取率高,准确,快速,操作成本低,减少原料预处理费并于环境无害的优点。微波射线穿透性好,在接近环境温度下抽提竹叶中所需有效成分,对于热敏性成分的萃取非常有效。然而,微波萃取在理论和实践中还存在一些问题,如有机溶剂的残留以及微波穿透物质内部时的衰减问题等,而且目前这种提取方法仍沿袭高温煎煮法,长时间高温煎煮会影响许多有效成分,降低药效。破碎提取法(,)通过选用各种性质的药材,与几种传统提取方法所得提取物产率和薄层层析对比试验,结果表明,破碎提取法提取快速、完全,且不需要加热,从而避免了对竹叶中有效成分结构的破坏,有效成分的损失小,提取周期短,可以节省大量时间、溶剂和能源,但是提取物的收率并不是最高,且也局限于实验研究,要应用于大生产,还需进一步研究。超临界流体萃取法⑿超临界流体萃取技术是利用临界或超临界状态的流体及被萃取的物质在不同的蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离纯化的操作。被用作超临界流体的溶剂有CO、HO、CH、CH、CHOH、NO等,其中CO以临界条件易达到(Tc=e,Pc=MPa)且无毒、无味、不燃、价廉、易精制等特性应用最为普遍。超临界提取类黄酮和传统的溶剂提取相比具有一系列优点:操作周期短、提取效率高、无溶剂残留以及有效成分和热不稳定的成分不易被分解,从提取到分离可一步完成,可选择性提取和分离纯化,溶剂溶质分离方便。但是该法生产成本高,提取物中烷基酚含量较高,超临界CO是非极性溶剂,对非极性和分子量很低的极性物质表现出很好的溶解性,但对极性较强的物质溶解能力不足。在竹叶黄酮的提取应用上效果不显著。参考文献⑴张英竹叶黄酮的生理与药理活性J世界竹藤通讯,,():⑵陆柏益,张英,吴晓琴竹叶黄酮的抗氧化及其心脑血管药理活性研究进展J林产化学与工业,,():⑶国家医药管理局中草药中心情报站药物有效成份手册M,北京:人民卫生出版社,⑷杨洋陈朝勇韦小英李秋庭竹叶黄酮的提取和纯化工艺研究(广西大学生物技术与糖业工程学院南宁食品科技⑸王振宇杨春瑜金钟跃超声波提取芦荟凝胶定工艺东北林业大学学报第卷()⑹刘振南。用正交法探讨山楂叶中黄酮类化合物的乙醇提取工艺广西民族学院学报(自然科学版),第卷()⑺李秀信,刘青利,张院民等香椿叶总黄酮提取方法研究西北林学院院报第!卷()⑻刘羽中,杨洋生物类黄酮提取研究进展J中外食品,,:⑼曾里,刘世贵微波技术应用于银杏黄酮浸提的研究四川大学学报(自然科学版),,():⑽OkudaTYoshidaTandHatanoT,JNat,Prod():⑾袁珂,简秀梅,孟江车前草不同提取方法的比较研究J中国现代应用药学杂志,,():⑿张镜澄超临界流体技术原理和应用M北京:化学工业出版社,⒀陶文亮吴钰娟竹叶黄酮提取分析方法的研究及其新进展(贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳)贵州化工

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